Glycine N-methyltransferase Adalah Sebuah Contoh Keanekaragaman Fungsional Berperan Sebagai suatu polycyclic hidrokarbon aromatic-Reseptor pengikat

Sitokrom P-4501A1 (CYP1A1) gen diatur oleh beberapa faktor trans-acting termasuk 4 S polycyclic aromatik hidrokarbon (PAH)-binding protein, yang baru-baru ini diidentifikasi sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT) (Raha, A., Wagner, C., Macdonald, R. G., dan Bresnick, E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 5750 -- 5756). Peran GNMT sebagai 4 S PAH-mengikat protein menengahi induksi sitokrom P-4501A1. Beberapa klon positif dipilih oleh transcription-polymerase reaksi berantai dan diuji untuk ekspresi protein rekombinan.
Hidrokarbon Polisiklik Aromatik seperti B [a] P1, 3 methylcholanthrene, dan TCDD adalah polusi lingkungan yang mendatangkan berbagai beracun, teratogenic, dan karsinogenik tanggapan di terekspos hewan (1-7). Induksi diperantarai oleh reseptor seperti reseptor Ah (atau dioxin reseptor, 8 S protein). Mekanisme Ah yang diperantarai reseptor dicirikan dari yang terbaik dan paling luas diterima PAH-model untuk ekspresi induksi CYP1A1 (9, 10). Ligan mengikat Ah reseptor yang bergantung pada suhu transformasi didampingi oleh translokasi ke inti di mana kompleks ligan mengikat reseptor spesifik cis-elemen (juga dikenal sebagai XREs dan Dres) hadir di 59-peraturan daerah CYP1A1 dan dari beberapa gen lain Ah. Hasil dari interaksi tersebut adalah Ah transkripsional responsif aktivasi gen (3, 5, 6, 11). Ah reseptor yang berisi 95-kDa loop helix-heliks motif, karakteristik beberapa transkripsional aktivator (12, 13).
Peruntunan parsial dari 33-kDa protein 4 S menunjukkan identitasnya sebagai GNMT (S-adenosylmethionine: glisin N-methyltransferase, EC 2.1.1.20). Berdasarkan sejumlah kriteria, GNMT dan 4 S PAH-mengikat protein yang ditampilkan untuk menjadi satu dan menjadi protein yang sama (34).
Kami menyimpulkan GNMT terlibat dalam aktivasi transkripsional dari CYP1A1, sehingga memberikan alternatif, Ah reseptor-mempunayi jalur tersendiri untuk modulasi ekspresi CYP1A1 oleh tertentu PAHs, seperti B [a] P, B [e] P, dan 3-methylcholanthrene.


Bahan Dan Metode

Kimia-medium kultur jaringan, yang-lumayan penting, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin itu dibeli dari Life Technologies, Inc sumber bahan lain adalah: [a-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine, CA); [3H] B [a] P
(60 Ci / mmol) dari Amersham Corp; [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore (Bedford, MA); S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH); BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Biochemica Boehringer Mannheim Corp (Indianapolis, IN); Tris, TEMED,Tween 20, B [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA itu baik disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin).
Plasmid konstruksi dan transfection-The GNMT cDNA ini disintesis dengan RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) 1 RNA persiapan.GNMT spesifik yang maju dan reverse primer adalah 59-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGAC dan 59-TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing. Produk berikutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan identik dengan diterbitkan GNMT cDNA (43). Dua situs kloning untuk NheI dan XhoI dimasukkan ke dalam daerah noncoding dari GNMT cDNA oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI-dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid membangun, pMAMneo / GNMT, berisi yang GNMT masukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi sebagai ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan dan tekad. pMAMneo / GNMT adalah transfected ke sel CHO oleh Lipofectin metode. Singkat, pada hari 0, 10 mg DNA dalam 100 ml Opti-MEM aku dicampur dengan 15 ml Lipofectin reagen, dilapisi ke sekitar 2 3 105 sel dalam 2 ml serum pertumbuhan bebas menengah, dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 ° C dalam inkubator CO2. DNS transfectants didirikan menggunakan DNA dari plasmid pMAMneo orangtua. Pada hari 1, DNA menengah digantikan oleh standar serum-termasuk pertumbuhan menengah, dan inkubasi dilanjutkan untuk tambahan 48 h. Pada hari 4, sel-sel ditempatkan dalam medium yang mengandung pilihan geneticin (0,4 mg / ml). Klon sel tunggal yang dipetik, ditanam di medium seleksi, dan diuji untuk GNMT ekspresi melalui Western blotting dan B [a] P Aktivitas mengikat. SDS-Polyacrylamide Gel Elektroforesis dan Western blotting-The transfected secara stabil klon sudah dewasa dalam medium minimal esensial mengandung 0,4 mg / ml G418, 10% dialyzed serum janin sapi, dan 1 mM deksametason.

Hasil

Kurangnya aktivitas reseptor Ah dikonfirmasi oleh fungsional assay nuklir melibatkan XRE translokasi dan mengikat eksperimen dengan GNMT CHO-sel; HEPA-1 tikus hepatoma sel digunakan sebagai kontrol positif . Pembentukan dari XRE-Ah reseptor kompleks ditunjukkan dengan ekstrak dari cytosolic HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vitro dengan TCDD (jalur 2). Tidak kompleks seperti demonstrasi -
FIG. 3. Analisis gradien densitas sukrosa B [a] p (A) dan TCDD (B) cytosolic CHO mengikat dengan protein. The cytosolic protein (0,5-1 mg) telah diinkubasi dengan [3H] B [a] P (A) atau [3H] TCDD (B) untuk 60 menit pada 4 ° C dan selama 2 jam pada suhu kamar, masing-masing
Pembentukan reseptor XRE-Ah rumit juga dibuktikan dengan ekstrak nuklir dibuat dari HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vivo dengan TCDD (jalur 4). Sekali lagi, tidak kompleks seperti diamati dengan diobati TCDD-CHO-GNMT ekstrak nuklir (jalur 8).

Diskusi

Sebagai kesimpulan kami telah menunjukkan bahwa GNMT adalah PAH-binding protein yang menjadi perantara induksi CYP1A1 oleh Ah reseptor-jalur independen. Penyelidikan tambahan diperlukan untuk lebih memahami faktor-faktor yang mengatur
GNMT jumlah dan karena itu dimerik mengendalikan ekspresi dari CYP1A1.